نمونههای تحت بررسی توسط میکروسکوپ الکترونی به روشهای گوناگونی نیاز به آمادهسازی دارند تا نتیجهای درست و دقیق در تصویربرداری حاصل شود. برای دستیابی به بهترین نتیجه، فرآیند آماده سازی نمونه میتواند شامل مراحل مختلفی مانند شستن، خشک کردن، تثبیت، بارگذاری و لایهنشانی باشد. عدم انجام مراحل آمادهسازی نمونه پیش از تصویربرداری میتواند منجر به تخریب عملکرد دستگاه تصویربرداری، کیفیت تصویر و ساختار نمونه شود.
SEM چیست؟
میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM)، ابزاری قدرتمند برای کسب اطلاعات در مورد ساختار و سایر ویژگیهای نمونه در مقیاس نانو است. این میکروسکوپ، امکان بررسی نمونههای مختلف از جمله سرامیکها، فلزات، آلیاژها، نیمههادیها، نمونههای بیولوژیکی و … را با ثبت تصویر در مقیاس نانومتر فراهم میآورد.
چرا نمونه SEM باید آمادهسازی شود؟
از آنجا که نمونههای حاوی آب، سیستمهای تحت خلاء (مانند محفظه SEM) را دچار مشکل خروج گاز میکنند (پدیده outgassing)، نمونههای SEM باید خشک باشند. همچنین ممکن است دمای سطح نمونه در اثر برخورد الکترونهای پر انرژی به آن، افزایش یافته و موجب پدیده تبخیر و گاززدایی (outgassing) و همچنین افزایش آلایندههای موجود در محفظه، و در نتیجه کاهش کیفیت تصویر شود. علاوه بر آن، بالارفتن دمای سطح نمونه میتواند منجر به آسیب دیدن نمونه شود.
افزون بر خشک بودن، نمونه SEM باید رسانا نیز باشد تا از تجمع بار الکتریکی بر روی سطح نمونه در اثر برخورد پرتو الکترونی جلوگیری شود (شکل ۱). بدین منظور نمونههای نارسانا با لایهای نازک از مادهای رسانا پوشش داده میشوند.
پوششدهی نمونههای میکروسکوپ الکترونی مزایای دیگری نیز دارد. یکی از مزیتهای آن کاهش عمق نفوذ پرتو الکترونی است که موجب میشود تصویر نهایی تنها ساختار سطح رویی نمونه را نشان دهد و الکترونها از لایههای زیرین به دتکتور نرسند. بدین ترتیب، تابش الکترونهای ثانویه و نسبت سیگنال به نویز در نمونههای لایهنشانی شده بهبود مییابد، که منجر به تصویربرداری با رزولشن و دقت بالاتری میشود.
بدین ترتیب، در مورد بعضی از نمونهها لازم است که تحت فرآیند آماده سازی قبل از تصویربرداری SEM قرار گیرند.
فرآیند آماده سازی نمونه SEM
چگونگی آمادهسازی نمونه برای تصویربرداری SEM به طور کلی به نوع نمونه و ویژگیهای آن بستگی دارد، بدین ترتیب، نمونه ممکن است به بعضی یا تمام مراحل آمادهسازی زیر نیاز داشته باشد:
- تمیز کردن و برش دادن
- تثبیت
- آبزدایی کردن
- خشک کردن
- قرار دادن بر روی نمونهگیر SEM
- لایهنشانی با یک ماده رسانا
روشهای آمادهسازی نمونه SEM
-
تمیز و خشک کردن نمونه
برای دستیابی به تصاویری شفاف، تمیز کردن نمونهها مرحلهای مهم در آمادهسازی نمونه SEM به شمار میرود. چربیزدایی و خشک کردن نمونهها، موجب کاهش خروج گاز (outgassing) از آلودگیهای ارگانیک و آب باقیمانده در نمونه میشود. بعضی نمونهها مانند نمونههای پلیمری، مواد معدنی، خاک، زئولیت و پارچه ممکن است حاوی رطوبت یا گاز محبوس شده باشند که نیازمند انجام فرآیندهای خروج گاز از نمونه برای تصویربرداری توسط میکروسکوپ الکترونی است. برای تمیز و خشک کردن نمونهها میتوان از روشهای زیر استفاده کرد:
- شست و شوی نمونهها با محلولهای فرّار مانند استون، متانول و ایزوپروپانول
- قرار دادن نمونه در حمام فراصوت (اولتراسونیک) (برای جلوگیری از آسیب رسیدن به ساختار فیزیکی نمونه، استفاده از حمامهای توان بالا توصیه نمیشود)
- خشک کردن نمونه توسط گاز فشرده یا آون/هاتپلیت در صورت شست و شوی نمونه با آب
- استفاده از دستکشهای تمیز در تمامی مراحل آمادهسازی نمونه (چربی دستها منبع اصلی outgassing در سیستمهای تحت خلاء است)
همچنین بعضی از نمونهها باید پیش از قرار داده شدن بر روی پایه SEM بریده، صیقل داده و یا دچار خوردگی (مانند خوردگی توسط پلاسما (plasma etching)) شوند.
نمونههای ظریف و حاوی گاز نیز باید با احتیاط تحت فرآیندهای آمادهسازی قرار گیرند، زیرا ممکن است در حین فرآیندهای خلاءسازی سریع محفظه دچار تغییر شکل و آسیب شوند.
آماده سازی انواع نمونهها
-
نمونههای زیستی
نمونههای زیستی باید تحت فرآیندهای تثبیت و آبزدایی، مانند فریزدرای شدن یا انجماد نقطه بحرانی (CPD)، قرار گیرند و سپس برای خروج آب داخل نمونه باید خشک شوند. بدین ترتیب تصویربرداری SEM در خلاء بالاتر و تهیه تصاویر با وضوح بیشتر امکانپذیر میشود. همچنین نمونههای مرطوب که قابلیت آبزدایی ندارند میتوانند توسط SEM سرد (Cryo-SEM) تصویربرداری شوند.
-
نمونههای پودری
از آنجا که نمونههای پودری در محیط خلاء در محفظه SEM ممکن است در فضا پراکنده شوند، باید تحت فرآیند آمادهسازی قرار گیرند. نمونه پودری در مقادیر زیاد را میتوان تحت فشار به قرص تبدیل نمود. مقادیر کم پودرهای در ابعاد میکرون را میتوان بر روی چسب کربنی پراکنده نمود و سپس با جریان گاز N۲ پودرهای اضافی را برداشت. پودرهای در ابعاد نانو باید در یک حلال فرّار با استفاده از روش اولتراسونیک یا روشهای دیگر به خوبی توزیع شوند و یک قطره کوچک از آن را بر روی زیرلایه مناسب لایهنشانی نمود. فیلتراسیون خلاء نیز روشی دیگر برای آمادهسازی نمونههای پودری برای تصویربرداری SEM است.
-
نمونههای نارسانا
نمونههای نارسانا (مانند نمونههای زیستی) میتوانند الکترونهای پرتو فرودی را بر روی سطح خود به دام بیندازند و منجر به تشکیل نقاط روشن در تصویر SEM شوند. همچنین این تجمع بار الکتریکی بر سطح نمونه میتواند موجب افزایش دما و تخریب نمونه شود. برای جلوگیری از این پدیده، یک لایه از مادهای رسانا بر روی نمونه لایهنشانی میشود (شکل ۳). ضخامت لایه باید به اندازهای باشد که مانع باردار شدن سطح شود و از طرفی نیز خصوصیات سطح نمونه حفظ شود (حدود ۱۰ نانومتر).
لایهنشانی لایهای از طلا، نقره، پلاتین یا کروم برای تصویربرداری SEM و لایهنشانی کربن برای طیفسنجی پراش انرژی پرتو ایکس (EDX) (به دلیل عدم تداخل خطوط طیف کربن با طیف نمونه در مقایسه با طلا) مناسب است. برای مطالعه جزئیات بیشتر در مورد ویژگیهای ماده مورد لایهنشانی، به مقاله انتخاب ماده مناسب برای آماده سازی نمونه میکروسکوپ الکترونی مراجعه نمایید.
تکنیکهای پوششدهی روی نمونههای SEM
پوششدهی کندوپاشی
در روش سنتی کندوپاش دیودی که از فلزات با بازده کندوپاش بالا، مانند نیکل، طلا، طلا-پالادیوم و پلاتین استفاده میکند، انرژی ثانویه الکترونهای آزاد بسیار بالا است که میتوان با اعمال کندوپاش بایاس بر آن غلبه کرد. سایر تکنیکهای کندوپاش، مانند کندوپاش مگنترون و کندوپاش پرتو یونی، برای امکان لایهنشانی فلزاتی مانند پلاتین، تنگستن، تانتالیوم و کروم توسعه یافتهاند.
کندوپاش مگنترون
در کندوپاش مگنترون، از یک کاتد کندوپاش حاوی چینشی از آهنرباها برای اعمال میدان مغناطیسی بر روی هدف استفاده میشود و ذرات پلاسما را محدود میکند. این تکنیک امکان لایهنشانی پوششهای ریزدانه از فلزاتی مانند کروم یا تنگستن را در محیطی با خلاء بالا فراهم میکند که منجر به ایجاد لایههای رسانا با وضوح بالا و ایدهآل برای تصویربرداری FE-SEM میشود. این تکنیک در اسپاترکوترهای خلاء بالای شرکت پوششهای نانوساختار، مانند DST1-170 و DST1-300 ارائه میشود.
رسوبدهی با پرتو یونی (IBSD)
اسپاترینگ با پرتو یونی میتواند ساختارهای ریزدانه با ضخامتهای بسیار کم (زیر ۱ نانومتر) را در یک محفظه با دمای پایین ایجاد کند تا نتایج تصویربرداری از میکروسکوپ الکترونی نمونههای زیستی را بهبود بخشد.
تبخیر
تبخیر حرارتی و تبخیر با پرتو الکترونی منابع فلزی یا کربنی برای پوششدهی نمونههای SEM جهت ایجاد پوششهای ریزدانه روی نمونه قابل استفاده هستند.
پوششدهی کربن، به صورت نخ یا میله کربنی، با روش تبخیر حرارتی اغلب برای تصویربرداری SEM/FE-SEM همراه با آنالیز EDX/EDS استفاده میشود، زیرا طیف اشعه ایکس کربن به دلیل عدد اتمی پایین آن، با نمونه تداخل نمیکند. کربن کوترهای شرکت پوششهای نانوساختار، از جمله DCR، DCT و DCT-300، و همچنین پوششدهندههای هیبریدی مانند DSCR و DSCT، پوششدهی کربن لایه نازک را برای آنالیز SEM، FE-SEM و EDX امکانپذیر میکنند، جایی که سیستمهای خلاء بالا (DCT،DSCT و DCT-300) امکان پوششدهی لایههای آمورف بیشتر را برای آنالیز با وضوح بالا فراهم میکنند.
سایهگذاری با لایه فلزی (سایهگذاری در زاویه مایل)
سایهگذاری یک نمونه بیولوژیکی معمولاً با تبخیر یا لایهنشانی کندوپاشی یک فلز با چگالی بالا در زاویه مایل بر روی نمونه انجام میشود که منجر به ایجاد یک لایه یکنواخت، بدون ساختار و بسیار نازک (با ضخامت کمتر از ۰.۱ نانومتر) میشود.
زاویه مایل چگونه به تصویربرداری از ساختارهای ظریف کمک میکند؟
اشیاء کوچکتر باید در زوایای کوچکتر سایهگذاری شوند. لایهنشانی در زوایای مایل، بخشهای نسبتاً بالاتری از نمونه را میپوشاند که سایه جزئی یا کلی را در جهت مخالف منبع ایجاد میکند.
تصویربرداری SEM/TEM از سطوح سایهگذاری شده
نمونههای سایهدار فلزی از طریق میکروسکوپ الکترونی، SEM یا TEM قابل مشاهده هستند. نواحی ضخیمتر پوشش داده شده با فلز، پرتو الکترونی بیشتری را پراکنده میکنند و در TEM به عنوان نواحی تیرهتر ظاهر میشوند، در حالی که پوششهای نازکتر در برابر پرتو شفاف بوده و در TEM روشن به نظر میرسند. در SEM کاملاً برعکس است.
روشهای سایهافکنی: تکجهته و چرخشی
روش سایهافکنی تکجهته برای بررسی سطوح بیولوژیکی نرم و رفتار ترشوندگی میکرو و نانوذرات در فصل مشترک مایع-مایع با استفاده از روش سایهافکنی انجماد-شکست (FreSCA) قابل استفاده است.
استفاده از تکنیکهای سایهزنی چرخشی، که در آن نمونه روی یک نگهدارنده نمونه چرخشی قرار میگیرد، منجر به تجسم سهبعدی و جزئیات سطحی ویروسها، باکتریها، پروتئینها یا DNA میشود.
شکل ۵. لایههای نازک سایهاندازی شده از لایههای پلاتین/کربن روی سطحی با ساختار پیچیده.
دستگاههای لایه نشانی در خلاء و آمادهسازی نمونه
بنابراین، انتخاب بهترین روش آمادهسازی نمونه برای تصویربرداری توسط میکروسکوپ الکترونی به نوع میکروسکوپ، شرایط تصویربرداری و کیفیت تصویر مورد نیاز بستگی دارد.
شرکت پوششهای نانوساختار سیستمهای لایهنشانی با دقت بالا با کاربردهای مختلف تولید میکند. لایهنشانهای میکروسکوپ الکترونی شرکت پوششهای نانوساختار قادر به ایجاد لایههای نازک رسانا بر روی نمونههای میکروسکوپ الکترونی به منظور بهبود کیفیت تصویربرداری توسط SEM/FESEM هستند. اسپاترکوترهای مجهز به پمپ خلاء روتاری و توربومولکولار، با ایجاد خلاءهای پایین و بالا (DSR1 و DST1)، به عنوان لایه نشان های میکروسکوپ الکترونی انتخاب مناسبی برای آمادهسازی نمونه SEM هستند.
همچنین، این شرکت دستگاههای لایهنشانی کربن در خلاء پایین و بالا (DCR و DCT) را ارائه میدهد. دستگاههای ترکیبی اسپاترینگ و لایهنشانی کربن (DSCR و DSCT) شرکت پوششهای نانوساختار، امکان انجام لایهنشانی به هر دو روش اسپاترینگ و لایهنشانی کربن را در یک سیستم لایهنشانی رومیزی دارا هستند.
ویژگیهای منحصر به فرد دستگاههای پوششهای نانوساختار
ضخامت سنج کریستال کوارتز با دقت بالا، شاترهای الکترونیک، چرخاننده نمونه، صفحه نمایش لمسی رنگی ۷ اینچی و نرمافزار کاربرپسند قابل به روزرسانی، همگی از ویژگیهای این سیستمهای لایهنشانی رومیزی هستند. دستگاه DST1 در دو اندازه محفظه به قطرهای ۱۷۰ و ۳۰۰ میلیمتر ارائه میشود. همچنین، ویژگیهای انتخابی مانند اسپاترینگ RF، تمیزکننده پلاسمایی، اعمال ولتاژ بایاس و گرمکننده زیرلایه نیز در صورت نیاز کاربر عرضه میشود.
دستگاههای لایه نشانی در خلاء ما
منابع
- Polilov, A.A., Makarova, A.A., Pang, S. et al. Protocol for preparation of heterogeneous biological samples for 3D electron microscopy: a case study for insects. Sci Rep 11, 4717 (2021) https://doi.org/10.1038/s41598-021-83936-0
- Echlin, Patrick. Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. Springer Science & Business Media, 2011.
- Hendricks GM. Metal shadowing for electron microscopy. Methods Mol Biol. 2014;1117:73-93. doi: 10.1007/978-1-62703-776-1_5.
- Peters, K-R. “Metal deposition by high-energy sputtering for high magnification electron microscopy.” Advanced Techniques in Biological Electron Microscopy III. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 1986. 101-166.
- Isa, L. (2013). Freeze-fracture Shadow-casting (FreSCa) Cryo-SEM as a Tool to Investigate the Wetting of Micro- and Nanoparticles at Liquid–Liquid Interfaces. CHIMIA, 67(4), 231. https://doi.org/10.2533/chimia.2013.231.
- http://www9.open.ac.uk/emsuite/services/sem-and-tem-sample-preparation-materials
- https://ywcmatsci.yale.edu/facilities/sem/sample-preparation
- Murtey, Mogana, Ramasamy, Patchamuthu. “Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy – Life Sciences”. Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences, edited by Milos Janecek, Robert Kral, IntechOpen, 2016. 10.5772/61720.
- https://www.gu.se/en/core-facilities/sem-sample-preparation-techniques# Preparation-for-topography
- Nguyen, Jenny Ngoc Tran, and Amanda M. Harbison. “Scanning electron microscopy sample preparation and imaging.” Molecular Profiling. Humana Press, New York, NY, 2017. 71-84.
- https://bitesizebio.com/34150/sem-sample-prep/#fl-main-content
سلام ببخشید آیا امکان نگهداری نمونۀ SEM برای مدت طولانی در مرحلۀ خشک کردن پس از انجام مراحل آبزدایی و تثبیت نمونه، پیش از قرار دادن آن بر روی پایۀ نگهدارندۀ نمونۀ SEM، وجود دارد؟
سلام
برای ذخیره کردن نمونه های خشک برای مدت طولانی و حفظ ویژگیهای ساختاری آنها، باید نمونه ها در یک محیط با رطوبت بسیار پایین، مانند دسیکاتور، نگهداری شوند.
چگونه یک پودر از ماده ای نارسانا، مانند لیپوزوم، را برای تصویربرداری SEM آماده سازی می شود؟
توزیع پودر بر روی یک سمت از چسب دوطرفۀ رسانا، مانند چسب کربن یا مس، یکی از روشهای متداول آماه سازی نمونه های پودری برای SEM است. همچنین با لایه نشانی اسپاترینگ یک لایۀ نازک طلا (در حد چند آنگستروم) بر روی پودر رسانش الکتریکی نمونه بهبود یافته و تصویر SEM واضحتر می شود.
مراحل آماده سازی نمونۀ گریس، مانند گریس ترکیب لیتیوم-کربن برای تصویر برداری SEM چگونه است؟
“از آنجا که محفظۀ نمونه در مشخصهیابی SEM نیاز به خلاء بالا دارد، روغن موجود در نمونۀ گریس یا لوبریکانتها باید جدا شود تا بتوان ساختار نمونه را تحت SEM بررسی کرد. مراحل مرسوم در آماده سازی نمونۀ گریس برای SEM به ترتیب زیر است:
1- جداسازی روغن موجود در نمونه با فروبردن آن در یک حلال ارگانیک.
2- جداسازی کامل روغن با تعویض محلول ۳-۴ بار در روز.
3- خشک سازی نمونه در دمای اتاق برای چند روز.
4- لایهنشانی نمونه با لایهای نازک از طلا برای جلوگیری از باردار شدن سطح نمونه و کاهش آسیب حرارتی و تقویت سیگنال الکترون بازتابیده در آنالیز SEM.”
تصویربرداری از نمونه های متخلخل توسط میکروسکوپ الکترونی تحت چه شرایطی امکان پذیر است؟
“برای دستیابی به تصویری مطلوب از نمونه های متخلخل نیمه رسانا یا عایق توسط میکروسکوپ الکترونی باید نکات زیر را رعایت نمود:
1- برای تسریع انتقال بار الکتریکی از سطح نمونه به پایه نگهدارنده نمونه SEM بهتر است پیش از ایجاد پوشش رسانا بر روی نمونه، از نوار چسب کربنی یا چسب نقره برای اتصال لبههای نمونه و نگهدارنده استفاده نمود.
2- نمونه باید با یک ماده رسانا مانند طلا، نقره یا کربن به ضخامت حدود ۵ تا ۲۰ نانومتر (بسته به ساختار سطح نمونه) پوشش داده شود. ضخامت لایه باید به حدی باشد که مانع باردار شدن سطح در حین تصویربرداری شود و از سوی دیگر نیز خلل و فرج سطح را نپوشاند.
3- با کاهش ولتاژ شتابدهنده الکترونها در حین تصویربرداری تا ۲-۱ کیلوولت، انرژی الکترونهای برخوردکننده به سطح و عمق نفوذ آنها کاهش مییابد، در نتیجه الکترونها به عمق خلل و فرج و سطوح کمتر رسانا نمیرسند. تصویربرداری SEM با ولتاژ پایین و رزولشن بالا امکان مشاهده ساختارهای ریز سطوح متخلخل را فراهم میکند.”
چگونه یک نمونه بیوکار (Biochar) را برای تصویربرداری توسط میکروسکوپ الکترونی آماده کنیم؟
بیوکار یک ماده غنی از کربن است که در حین تجزیه گرمایی یک ماده زیستی تحت شرایط کمبود اکسیژن تولید می شود. با توجه به ساختار غنی از کربن آن به نظر می رسد رسانا باشد و به لایه نشانی ماده ای رسانا برای تصویربرداری SEM نیاز نداشته باشد.برای بررسی دقیقتر می توانید به مقالات علمی چاپ شده درا ین زمینه مراجعه بفرمایید.