آماده‌سازی نمونه میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM)

چرا نمونه SEM باید آماده‌سازی شود؟

از آنجا که نمونه‌های حاوی آب، سیستم‌های تحت خلاء (مانند محفظه  SEM) را دچار مشکل خروج گاز می‌کنند (پدیده outgassing)، نمونه‌های SEM باید خشک باشند. همچنین ممکن است مقداری از آب باقیمانده در نمونه در اثر برخورد الکترون‌های پر انرژی به آن، تبخیر و موجب کاهش کیفیت تصویر شود. علاوه بر خشک بودن، نمونه SEM باید رسانا نیز باشد تا از تجمع بار الکتریکی بر روی سطح نمونه در اثر برخورد پرتو الکترونی جلوگیری شود (شکل ۱). بدین ترتیب، در مورد بعضی از نمونه‌ها لازم است که تحت فرآیند آماده سازی قبل از تصویربرداری SEM قرار گیرند.

فرآیند آماده‌سازی نمونه SEM

چگونگی آماده‌سازی نمونه برای تصویربرداری SEM به طور کلی به نوع نمونه و ویژگی‌های آن بستگی دارد، بدین ترتیب، نمونه ممکن است به بعضی یا تمام مراحل آماده‌سازی زیر نیاز داشته باشد:

• تمیز کردن و برش دادن
• تثبیت
• آب‌زدایی کردن
• خشک کردن
• قرار دادن بر روی نمونه‌گیر SEM
• لایه‌نشانی با یک ماده رسانا

روش‌های آماده‌سازی نمونه SEM

• تمیز و خشک کردن نمونه

برای دستیابی به تصاویری شفاف، تمیز کردن نمونه‌ها مرحله‌ای مهم در آماده‌سازی نمونه SEM به شمار می‌رود. چربی‌زدایی و خشک کردن نمونه‌ها، موجب کاهش خروج گاز (outgassing) از آلودگی‌های ارگانیک و آب باقیمانده در نمونه می‌شود. برای تمیز و خشک کردن نمونه‌ها می‌توان از روش‌های زیر استفاده کرد:

• شست و شوی نمونه‌ها با محلول‌های فرّار مانند استون، متانول و ایزوپروپانول
• قرار دادن نمونه در حمام فراصوت (اولتراسونیک) (برای جلوگیری از آسیب رسیدن به ساختار فیزیکی نمونه، استفاده از حمام‌های توان بالا توصیه نمی‌شود)
• خشک کردن نمونه توسط گاز فشرده یا آون/هات‌پلیت در صورت شست و شوی نمونه با آب
• استفاده از دستکش‌های تمیز در تمامی مراحل آماده‌سازی نمونه (چربی دست‌ها منبع اصلی outgassing در سیستم‌های تحت خلاء است)

آماده سازی انواع نمونه‌ها

• نمونه‌های زیستی

نمونه‌های زیستی باید تحت فرآیند‌های تثبیت و آب‌زدایی قرار گیرند، و سپس برای خروج آب داخل نمونه باید خشک شوند. بدین ترتیب تصویربرداری SEM در خلاء بالاتر و تهیه تصاویر با وضوح بیشتر امکان‌پذیر می‌شود.

• نمونه‌های پودری

از آنجا که نمونه‌های پودری در محیط خلاء در محفظه SEM ممکن است در فضا پراکنده شوند، باید تحت فرآیند آماده‌سازی قرار گیرند. نمونه پودری در مقادیر زیاد را می‌توان تحت فشار به قرص تبدیل نمود؛ مقادیر کم پودر را باید در یک حلال فرّار توزیع و بر روی زیرلایه مناسب لایه‌نشانی نمود.

• نمونه‌های نارسانا

نمونه‌های نارسانا (مانند نمونه‌های زیستی) می‌توانند الکترون‌های پرتو فرودی را بر روی سطح خود به دام بیندازند و منجر به تشکیل نقاط روشن در تصویر SEM شوند. همچنین این تجمع بار الکتریکی بر سطح نمونه می‌تواند موجب افزایش دما و تخریب نمونه شود. برای جلوگیری از این پدیده، یک لایه از ماده‌ای رسانا بر روی نمونه لایه‌نشانی می‌شود (شکل ۳). ضخامت لایه باید به اندازه‌ای باشد که مانع باردار شدن سطح شود و از طرفی نیز خصوصیات سطح نمونه حفظ شود (حدود ۱۰ نانومتر). 

لایه‌نشانی لایه‌ای از طلا، نقره، پلاتین یا کروم برای تصویربرداری SEM و لایه‌نشانی کربن برای طیف‌سنجی پراش انرژی پرتو ایکس (EDX) (به دلیل عدم تداخل خطوط طیف کربن با طیف نمونه در مقایسه با طلا) مناسب است. برای مطالعه جزئیات بیشتر در مورد ویژگی‌های ماده مورد لایه‌نشانی، به مقاله انتخاب ماده مناسب برای آماده سازی نمونه میکروسکوپ الکترونی مراجعه نمایید.

دستگاه‌های لایه نشانی در خلاء و آماده‌سازی نمونه

شرکت پوشش‌های نانوساختار سیستم‌های لایه‌نشانی با دقت بالا با کاربردهای مختلف تولید می‌کند. اسپاترکوترهای مجهز به پمپ خلاء روتاری و توربومولکولار، با ایجاد خلاء‌های پایین و بالا (DSR1 و DST1)، به عنوان لایه نشان های میکروسکوپ الکترونی انتخاب مناسبی برای آماده‌سازی نمونه SEM هستند.

همچنین، این شرکت دستگاه‌های لایه‌نشانی کربن در خلاء پایین و بالا (DCR و DCT) را ارائه می‌دهد. دستگاه‌های ترکیبی اسپاترینگ و لایه‌نشانی کربن (DSCR و DSCT) شرکت پوشش‌های نانوساختار، امکان انجام لایه‌نشانی به هر دو روش اسپاترینگ و لایه‌نشانی کربن را در یک سیستم لایه‌نشانی رومیزی دارا هستند. 

ویژگی‌های منحصر به فرد دستگاه‌های پوشش‌های نانو‌ساختار

ضخامت سنج کریستال کوارتز با دقت بالا، شاترهای الکترونیک، چرخاننده نمونه، صفحه نمایش لمسی رنگی ۷ اینچی و نرم‌افزار کاربرپسند قابل به روزرسانی، همگی از ویژگی‌های این سیستم‌های لایه‌نشانی رومیزی هستند. دستگاه DST1 در دو اندازه محفظه به قطرهای ۱۷۰ و ۳۰۰ میلیمتر ارائه می‌شود. همچنین، ویژگی‌های انتخابی مانند اسپاترینگ RF، تمیزکننده پلاسمایی، اعمال ولتاژ بایاس و گرم‌کننده زیرلایه نیز در صورت نیاز کاربر عرضه می‌شود.

منابع

1. Polilov, A.A., Makarova, A.A., Pang, S. et al. Protocol for preparation of heterogeneous biological samples for 3D electron microscopy: a case study for insects. Sci Rep 11, 4717 (2021) https://doi.org/10.1038/s41598-021-83936-0
2. Echlin, Patrick. Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. Springer Science & Business Media, 2011.
3. http://www9.open.ac.uk/emsuite/services/sem-and-tem-sample-preparation-materials
4. https://ywcmatsci.yale.edu/facilities/sem/sample-preparation
5. Murtey, Mogana, Ramasamy, Patchamuthu. “Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy – Life Sciences”. Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences, edited by Milos Janecek, Robert Kral, IntechOpen, 2016. 10.5772/61720.
6. https://www.gu.se/en/core-facilities/sem-sample-preparation-techniques# Preparation-for-topography
7. Nguyen, Jenny Ngoc Tran, and Amanda M. Harbison. “Scanning electron microscopy sample preparation and imaging.” Molecular Profiling. Humana Press, New York, NY, 2017. 71-84.
8. https://bitesizebio.com/34150/sem-sample-prep/#fl-main-content